Cwiczenie 2 - mutageneza
Impreza plenerowa w KieĹpinie 22 kwietnia 2007
po tym mailu co Magda przeslala (dzieki jej za to) to tak troche malo wesolo sie przedstawia perspektwa nauki na te cw.. wogole ten artykul jest straszny..no ale ma ktos moze jakies materialy z ksiazke co to by mogl mi przyniesc jutro i uzyczyc do skserowania? bylabym bardzo wdzieczna i wogole..
podpisuje się pod tą prośbą
kto jest w posiadaniu tego Markiewicza?w ogole to jakaś masakra ;(dobrze gadają! niech się dzielą jak mają!
mi się prawie udało wypożyczyć tą biologię molekularną bakterii na amg ale wyskoczył błąd a dzień później już była wypożyczona. przyznać się - to ktoś od nas?
Ja mam biologię molekularną bakterii i mogę ją jutro przynieść, ale chcę ją też jutro odzyskać, więc z kserowaniem będziecie się musieli wyrobić na angielskim.
I jeszcze jedna sprawa - w spisie treści w skrypcie znajduje się podpunkt Hodowla Helicobacter pyroli, zaznaczone jako do nauczenia się. Czy ja jestem aż tak bardzo ślepy, czy tej strony brakuje w skrypcie?
A że tak zapytam przyziemnie: czy ze skryptu to tylko ta jedna marna kartka czyli strony 14 i 15? Bo temat o transdukcji (str 23) nie jest w naszym planie ćwiczeń odrębnie uwzględniony. A Helicobacter nie dość że nie ma w planie ćwiczeń to jeszcze stanowi rozdział-widmo w skrypcie (jest tylko w spisie treści).
Bo że 150 stron pana Markiewicza załatwia resztę, to już słyszałam.
str 23 chyba też. Jest tym samym kolorkiem zaznaczona w rozpisce
Tez mi sie wydaje ze 23 tez.. w koncu skoro pytaja o transdukcje..
Oto co udało mi się znaleźć o antybiotykach wymienionych w skrypcie. Korzystałem z Życia bakterii i biologii molekularnej bakterii. Jak zawsze, dobrze by było, gdyby ktoś to sprawdził:
kanamycyna
Działanie:
Wiaże się z którymś z białek małej lub dużej podjednostki rybosomu.
Oporność:
Pompa MATE (multidrug and toxic compounds efflux), występująca u Vibrio parahaemolyticus, napędzana siłą sodowomotoryczną. Uczestniczy w czynnym usuwaniu substancji toksycznych z komórek (między innymi kanamycynę).
Cząsteczka kanamycyny jest unieczynniana przez acetylację.
ampicylina
Działanie:
Należy do grupy beta-laktamaz. Autoliza komórki bakteryjnej wywoływana przez nadaktywność hydrolazy mureiny.
Oporność:
Chroniące białka periplazmatyczne rozcinają wiązanie amidowe w pierścieniu beta-laktamowym (beta-laktamazy) lub odcinające jego łańcuch boczny (acylazy, aminohydrolazy).
rifampicyna
Działanie:
Hamuje inicjację transkrypcji (działanie ryfamycyny (antybiotyku od którego pochodzi rifampicyna - najprawdopodobnie mają ten sam mechanizm) polega na wiązaniu się pierścieniem makrolidowym z centralną częścią podjednostki beta).
Oporność:
Mutacja w podjednostce beta polimerazy RNA.
chloramfenikol
Działanie:
Wpływa na bakterie, chloroplasty i mitochondria, nie wpływa na translację w cytoplazmie eukariota. Wiąże się w pobliżu centrum aktywnego peptydotransferazy, co prowadzi do zahamowania tworzenia się wiązania peptydowego. Do wiązania się chloramfenikolu niezbędna jest obecność funkcjonalnego białka L16, być może także L24 i L27 uczestniczą w jego wiązaniu.
Oporność:
Wypompowywany z komórki poprzez "system Acr" (system ten jest pompą) należący do klasy RND (Resistance-Nodulation-cell Division).
Acetylacja poprzez acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT - Chloramphenicol AcetylTransferase) oraz zmiany przepuszczalności osłon bakteryjnych.
tetracykliny
Działanie:
Wiązanie się z obiema podjednostkami rybosomu, głównie z białkami S4 i S18 w małej podjednostce. Tetracykliny hamują syntezę białka blokując wiązanie aminoacylo-tRNA z miejscem akceptorowym A.
Oporność:
Usuwany przez pompę ErmE u E.Coli, pompa ta należy do typu SMR (small multidrug resistance).
Istnieją różnorodne mechanizmy zwane opornością swoistą: enzymatyczna inaktywacja cząsteczek antybiotyku, aktywne usuwanie tetracykliny przez komórkę, ochrona rybosomu przed tetracykliną
erytromycyna
Działanie:
Wiąże się z miejscem P w podjednostce 50S w czym uczestniczą białka L15 i L16. Prawdopodobnie jej wiązanie blokuje proces translokacji rybosomów.
Oporność:
Wypompowywany z komórki poprzez "system AcrAB" lub "system Acr" (to najprawdopodobniej jedno i to samo, ale pewien nie jestem) (systemy ten są pompami) należącymi do klasy RND.
Antybiotyk ten należy do grupy makrolidów, opisano kilka mechanizmów oporności na tą grupę antybiotyków: modyfikacja struktury makrolidu przez fosfotransferazę, metylacja 23S rRna przez metylotransferazę, aktywne usuwanie cząsteczek bakteryjnych przy użyciu transportera typu ABC (ATP-binding cassette).
spektynomycyna
Działanie:
Jest aminocyklitolem, wiąże się z białkiem 5S i powoduje zablokowanie translokacji rybosomu.
Oporność:
Mechanizmy oporności na aminocyklitole to: acetylacja, adenylacja i fosforylacja antybiotyku, enzymatyczna modyfikacja 16S r RNA, zmiany struktury rybosomu i przepuszczalności osłon bakteryjnych dla leku.
jeżeli ktoś chce skan rekombinacji homologicznej niech daje znac.
ja chce ja chce!
Ja też proszę. Z czego te skany?
a tobie po co jak to z Markiewicza:P strony 273-282:) ale jak chcesz to ci wysle, jesli masz silna potrzebe posiadania ich:D
Nie wysyłaj, myślałem, że to coś czego nie mam
Ja prosić, bardzo
Ogólnie to naszą sytuację związaną z enzymami i biomolem dzień po dniu da się podsumować słowami" Houston, mamy problem..."
spoko, następne enzymy będą w dniu naszego biol mola i dzień po Waszym
To bedzie dzień zbiorowej paniki ;D
MUTAGENEZA TRANSPOZONOWA
Gr.1
1. roznica miedzy pMarB i pMarC
2. transdukcja ogólna a specyficzna
3. efekty wbudowania transpozonu
4. co to hot spot
Gr.2
1. roznica miedzy pMarA i pMarB i mozliwosci z tego plynace
2. Zalety transdukcji
3. mechanizm transpozycji cut & paste
4.Mechanizm oporności na kanamycyne.
Gr.3
1.co to jest: DDE, cząstka transdukująca, kompetencja.
2.Mechanizm cut&paste.
3.Roznica pomiedzy transpozonem a IS
Gr.4
1.opisać ruchomy element w plazmidzie z ćwiczeń
2.coś o różnicach w rekombinacji miejscowo specyficznej i ogólnej
3.jaki typ transdukcji przeprowadzają fagi lambda, P1 i jeszcze jakiś
4.co to jest transdukcja poronna i co to jest HGT
To moje wersje odpowiedzi. Ma ktoś jakiś pomysł na 2.1?
MUTAGENEZA TRANSPOZONOWA
Gr.1
1. roznica miedzy pMarB i pMarC
pMarB posiada wbudowany gen Himar1 i sekwencje docelowe dla endonukleaz BamHI SalI, między którymi znajduje się promotor PB genu transpozazy. pMarC ich nie posiada.
2. transdukcja ogólna a specyficzna
Ogólna - przenoszenie z niską częstością dowolnej cech chromosomowej (np. przez fagi P1 czy P22). W tych fagach pakowanie DNA do główek polega na odcinaniu z kontaktamerów DNA fagowego odcinków tak dużych, jak zmieszczą się w główce fagowej. Zaczyna się ona od sekwencji pac. Jeśli w genomie gospodarza znajduje sie podobna sekwencja, to endonukleaza fagowa może zacząc pakować ją do główek.
Specyficzna - przenoszenie tylko kilku określonych cech (np. przez faga lambda), zachodzi u fagów, u których do pragłówek pakowane jest DNA o ściśle określonej długości, mające na obu końcach sekwencje cos. Aby w tym przypadku zaszła transdukcja fragment DNA gospodarza musi mieć dwie sekwencje przypominające cos w określonej odległości (38 do 52 tysięcy par zasad) (przypomnijcie sobie DNA kontaktameryczne u faga lambda).
3. efekty wbudowania transpozonu
Nabycie przez komórkę właściwości kodowanych przez transpozon (opornośc na antybiotyki/jony metali ciężkich, zdolność do degradacji różnych związków, determinanty wirulencji)
Efektami wbudowania jakiegokolwiek elementu ruchomego mogą być:
Insercyjna inaktywacja genów (poprzez przerwanie ciągłości genu lub obecność sekwencji wyciszającej)
Wzmożona ekspresja genów i aktywacja wyciszonych genów (gdy IS posiada dodatkowy promotor w końcowej części elementu i wbuduje się we właściwe miejsce w genomie)
Powstawanie kointegratów - fuzyjnych replikonów (gdy w cząsteczce obecnych jest kilka replikonów zawierających daną IS. Replikon - cząsteczka DNA stanowiąca samodzielną jednostkę replikacyjną)
Delecje, inwersje, translokacje, duplikacje a nawet tworzenie transpozonów(gdy dwie IS obecne są w jednym replikonie i zajdzie między nimi rekombinacja homologiczna)
4. co to hot spot
Miejsce w którym prawdopodobieństwo zajścia rekombinacji genetycznej (włączenia transpozonu) jest szczególnie duże, preferowane miejsce insercji.
Gr.2
1. roznica miedzy pMarA i pMarB i możliwości z tego plynace
Róznią się jednym z miejsc restrykcyjnych (A ma KpnI, B ma BamHI) i czynnikiem transkrypcyjnym wykorzystywanym do kontroli (sigma A u pMarA który jest "housekeeping factor" i sigma B który jest "general stress response factor")
Nie wiem jakie z tego płyną możliwości, jeszcze na tyle nie zrozumiałem tego artykułu.
2. Zalety transdukcji
Można przenosić stosunkowo duże fragmenty genomu (do kilkudziesięciu tysięcy par zasad).
Przenoszone DNA jest chronione przez kapsyd wirusa, który ułatwia też jego wnikanie do komórki.
3. mechanizm transpozycji cut & paste
Transpozaza przecina obie nici DNA w obrębie flankujących IR (inverted repeats), co powoduje całkowite wycięcie elementu transpozycyjnego z sekwencji donorowej. Uwolnione końce IS (wraz z wolnymi grupami 3'-OH) moga znajdować się blisko siebie, wtedy razem z transpozazą tworzą TRANSPOZOSOM. Niektóre IS wytwarzają koliste formy pośrednie, ale wtedy do włączenia sekwencji wymagane jest przecięcie nici. W końcowej fazie transpozycji grupy 3'-oh atakuja nukleofilowo wiązania fosfodiestrowe sekwencji docelowej, następuje transestryfikacja czego konsekwencją jest transfer nici DNA i włączenie elementu do sekwencji docelowej. Na końcu polimeraza I DNA syntetyzuje brakujące nukleotydy doprowadzając do powstania powtórzeń DR (direct repeats).
4. Mechanizm oporności na kanamycyne.
jest wyżej.
Gr.3
1. co to jest: DDE, cząstka transdukująca, kompetencja.
DDE - charakterystyczny, konserwowany motyw aminokwasowy występujący w większości transpozaz. Tworzą go 2 asparaginiany i glutaminian. Ich obecność warunkuje aktywność enzymatyczną transpozaz.
cząstka transdukująca - cząstka bakteriofaga zawierająca obcy materiał genetyczny, który może być w wyniku infekcji fagowej przenoszony z jednej bakterii do drugiej.
kompetencja - stan komórki bakteryjnej, w którym jest ona zdolna do pobierania DNA ze środowiska w procesie transformacji
2. Mechanizm cut&paste.
jest wyżej.
3. Roznica pomiedzy transpozonem a IS
Sekwencje insercyjne - 0,5-3 kbp, zwarta, prosta struktura, niosą jedynie informację genetyczną potrzebną do własnej transpozycji
Transpozony - większe, bardziej złożona struktura, niosą informacje niezbędne do transpozycji i pojedyncze geny lub nawet całe ich ugrupowania.
Gr.4
1. opisać ruchomy element w plazmidzie z ćwiczeń
Element mariner pochodzi z muchy Haematobia irritans. Wbudowuje się w losowe miejsca w genomie. Jego celem jest dinukleotyd TA. Transpozycja następuje poprzez mechanizm cut&paste katalizowany poprzez transpozazę Himar1, która sama nie musi się znajdować wewnątrz sekwencji transpozycyjnej. Element ten, nazwany TnYLB-1 składa się on z genu oporności na kanamycynę oflankowanego dwoma sekwencjami docelowymi dla endonukleazy PstI. W ćwiczeniu wykorzystujemy 2 plazmidy zbudowane na jego podstawie: pMarB i pMarC. pMarC posiada miejsce restrykcyjne EcoRI,gen odporności na erytromycynę, origin replikacji, kolejne miejsce restrykcyjne EcoRI, gen oporności na ampicylinę, kolejny origin replikacji oraz transpozon TnYLB-1. Plazmid pMarB posiada także miejsce rozpoznawane przez endonukleazę SalI oraz gen Himar 1 C9, kodujący transpozazę.
2. coś o różnicach w rekombinacji miejscowo specyficznej i ogólnej
Zakładam, że chodzi o to samo co wyżej.
3. jaki typ transdukcji przeprowadzają fagi lambda, P1 i jeszcze jakiś
Jest wyżej, przy okazji transdukcji ogólnej i specyficznej.
4. co to jest transdukcja poronna i co to jest HGT
Transdukcja poronna opisuje przypadek, gdy nie dojdzie do integracji materiału genetycznego dawcy i biorcy. Materiał genetyczny dawcy może przez jakiś czas przebywać w komórce biorcy (aż nie zostanie zdegradowany), ale podczas podziału dziedziczy go tylko jedna komórka potomna.
HGT - (horizontal gene transfer) transfer horyzontalny (lub lateralny) genów. Nabywanie przez organizm genów w wyniku procesu innego niż otrzymanie ich od organizmu rodzicielskiego w wyniku rozmnażania. Może się odbywać przez koniugację (plazmidy), transdukcję (bakteriofagi), transformację (pobieranie DNA bezpośrednio z otoczenia).
czynnik sigma a występuje u wszystkich bakterii, czynnik sigma b tylko u niektórych rodzajów (Bacillus, streptococus, Listeria)
wprowadzenie obu czynników rozszerza działanie plasmidu na większą grupe bakterii
<sam koniec artykułu piękny:P >
wejściówa grupa 1 - kolejność losowa:
1. podaj rodzaj transdukcji oraz gospodarza: P1, P22, lambda, SPP1
2. czemu Tn1 i Tn9 są bardziej bleh od pMarXów, podaj 2 powody
3. jaki jest mechanizm przyłączenia się marinera?
4. różnica między HGT a VGT
5. tetracyklina - życie, twórczość, oporność
6. transdukcja poronna
O matko
a o ktorej skonczyliscie laby?
tak jakos kolo 16 30
dobry filmik
wejściówa grupa 1 - kolejność losowa:
3. jaki jest mechanizm przyłączenia się marinera?
jaki jest mechanizm transpozycji.
pyt 6 w istocie było bonusowe, bo marudziliśmy na pyt 2
można było wybrać jedno z nich.Pytania grupy 3
1. Co to jest: IS, metylacja DNA, transpozaza?
2. Na czym polega transdukcja (lub transformacja, nie pamiętam). Opisz mechanizm.
3. Podaj dwie metody selekcji mutantów bakteryjnych.
4. Były podane 4 kombinacje fenotypów, o różnej odporności na kanamycynę i erytromycynę. Trzeba było określić który z nich najczęściej pojawi się po transdukcji naszym plazmidem, a następnie hodowaniu w 50 stopniach i dlaczego.
5. Jak działa erytromycyna?
Drodzy Panstwo,
przesylam wyniki kolokwium II:
Joanna Nowacka 9.5/10
Adam Ossowicki 7.5/10
Mateusz Pikora 8.5/10
Paulina Pranszke 7/10
Natalia Przysiężna 7.5/10
Pozdrawiam wszystkich,
Joanna Karczewska
jakie są metody selekcji mutantów bakteryjnych??
ja napisałam, że poprzez pożywkę z antybiotykami i pożywkę z brakiem jakiejś substancji bez której przezyje tylko mutant.
Ale maxa nie miałam, więc moze niech ktoś jeszcze się wypowie
pyt gr 4
1. terminy: transpozosom, cząsteczka transdukcyjna, transpozon niezłożony
2. opisać działanie spektomycyny
3. opisać budowe elementu transpozującego z tego artykułu (bez budowy plazmidów bo za to ona obniża)
4. Były podane 4 kombinacje fenotypów, o różnej odporności na kanamycynę i erytromycynę. Trzeba było określić który wystąpi po transdukcji plazmidem pMarC w 30 stopniach i uzasadnić
5. opisać mechanizm transpozycji konserwatywnej.
6. testowe: jaka jest długość Direct repeats (prawidłowa odpowied -> jest charakterystyczna dla danej IS czy coś w tym stylu:) )
jeju jeju jeju
i znow nasze pyt:
1 transdukcja specyficzna
2 dzialanie rifampycyny i spektynomycyny (bez odpornosci)
3 testowe jakies, nie pamietam
4 czemu w 50 st C bakterie moga miec odpornosc na erytromycyne
5 roznice miedzy pMarA i pMarB
6 krotko rekombinacja homologiczna
wyniki są, przesłałam wszystkim zainteresowanym na maila :
małe pytanko - widział ktoś moją instrukcję od labów? (taka bez tej części technicznej) popisana dwoma charakterami pisma i trochę podniszczona :>